No meio científico, a técnica CRISPR vem sendo aplicada em diversas áreas, como no modelamento de doenças em laboratório, na elaboração de tratamentos para doenças, no desenvolvimento de vacinas, no controle de pragas e no melhoramento da resistência e eficiência da produção agropecuária

Por Cristina Sanches

O sistema CRISPR (sigla em inglês para Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; em português, Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas), é uma ferramenta potente e precisa para edição de DNA. Ele designa sequências de DNA específicas presentes em alguns genomas bacterianos. “Descobriu-se, após a sua identificação, que estas sequências bacterianas eram responsáveis por reconhecer sequências de vírus invasores e direcionar um combate a eles por meio de enzimas que provocam quebras no genoma viral. Parte do genoma viral quebrado é também incorporado ao DNA bacteriano dentro do locus CRISPR, que, como um banco de dados, servirá de molde para direcionar respostas a infecções futuras”, explica Luciano Abreu Brito, mestre e doutor em Ciências Biológicas (Biologia Genética) pela Universidade de São Paulo. Pós-doutorando no Laboratório de Genética do Desenvolvimento do Centro de Estudos do Genoma Humano, também da Universidade de São Paulo.

Brito comenta que uma adaptação do Sistema CRISPR foi fundamental para o propósito de edição gênica, que consiste no uso de uma única molécula de RNA adaptável para se parear a qualquer sequência de DNA de maneira específica e ao mesmo tempo se ligar à uma enzima capaz de cortar esta molécula de DNA. Foi essa adaptação que rendeu às pesquisadoras Emmanuele Charpentier e Jennifer Doudna o prêmio Nobel de Química de 2020.

“O sistema CRISPR utilizado hoje para edição gênica consiste em um RNA-guia, cuja sequência é determinada de forma complementar à sequência do DNA-alvo, e uma enzima capaz de clivar a sequência-alvo quando associada ao RNA-guia (a mais usada das enzimas é a Cas9).”

Quando o sistema CRISPR foi adaptado para uso humano em laboratório, os cientistas começaram a observar o quão diferentes eles eram em relação às suas enzimas Cas (enzimas associadas a CRISPR, do inglês CRISPR-associated), que são responsáveis por seguir o RNA guia e cortar o DNA em locais especificados pelo RNA guia.

Os sistemas CRISPR-Cas são continuamente alvo de pesquisa de cientistas que buscam deixar as ferramentas de edição de DNA o mais precisas possível.

Existem diversas enzimas Cas, mas a mais conhecida é chamada Cas9. Ela vem da Streptococcus pyogenes, uma bactéria conhecida por causar infecção na garganta. Inicialmente descrita com o sistema CRISPR, reconhece e corta moléculas de DNA e foi adaptada para fazer edições de genoma.

No meio científico, a técnica CRISPR vem sendo aplicada em diversas áreas, como no modelamento de doenças em laboratório, na elaboração de tratamentos para doenças, no desenvolvimento de vacinas, no controle de pragas e no melhoramento da resistência e eficiência da produção agropecuária.

CRISPR na prática clínica

Apesar da técnica já ser disseminada pelo mundo, um dos grandes desafios para o uso clínico é desenvolver o melhor método de entrega do sistema CRISPR. “Isso porque os componentes do sistema precisam ser de alguma maneira empacotados e enviados para as células e tecidos, que devem especificamente ser corrigidos, e a forma de fazer isso varia de doença para doença”, explica Abreu.

“Entretanto”, continua ele, “alguns testes clínicos vêm sendo realizados para algumas doenças cujo método de entrega é via corrente sanguínea. Por exemplo, testes para o tratamento de anemia falciforme e beta talassemia, duas graves doenças que comprometem o funcionamento das hemoglobinas, além de alguns tipos de câncer, via imunoterapia com células imunes T retiradas do paciente, editadas in vitro para alterar genes e melhorar a capacidade de atacar células tumorais, e reimplantadas no paciente.

O que pode ser um incentivo para ampliar o uso do sistema CRISPR é seu baixo custo e facilidade de uso. “Isso se deve ao fato do CRISPR se basear, para o reconhecimento da sequência de DNA a ser editada, no pareamento de nucleotídeos com uma molécula de RNA, o que é mais barato, fácil e versátil em relação a técnicas precursoras (como TALENS ou zinc-finges), que se baseiam na interação entre proteínas e DNA”, diz Abreu.

Para fins diagnósticos, o sistema CRISPR pode ser usado para detecção de patógenos, como vírus de DNA e RNA. Um exemplo foi o teste desenvolvido pela Sherlock Biosciences para o diagnóstico da Covid-19, aprovado em 2020 pela Food and Drug Administration (FDA). Nestes testes, o sistema CRISPR é adaptado para, in vitro, reconhecer as sequências virais presentes em fluidos (por exemplo, saliva), após uma reação para amplificação do material genético do vírus.

Abreu explica que: ‘neste caso, o sistema CRISPR se utiliza da enzima Cas13, capaz de disparar uma série de eventos de clivagem, sendo este aumento de atividade detectado por aumento da fluorescência na reação.” Em testes de papel mergulhados em uma amostra de paciente – sangue, urina ou saliva – isso aparece como uma linha na tira de teste, semelhante a um resultado em um teste de gravidez.

Simplificar o uso de equipamentos: um desafio para o sistema CRISPR

O diagnóstico baseado na detecção de ácidos nucleicos está entre os tipos de testes mais sensíveis e específicos, todavia, esses ensaios usualmente requerem equipamentos de alto custo e a necessidade de pessoal altamente treinado. “O mecanismo do sistema CRISPR-Cas permite que os testes moleculares baseados na técnica sejam altamente programáveis, possibilitando fácil adaptação para diferentes alvos, inclusive em ensaios multiplex, com uma grande especificidade, enquanto mantêm uma sensibilidade adequada”, explica Jenifer Nowatzki, especialista em Vendas Técnicas na Thermo Fisher Scientific.

Segundo Jenifer muito tem-se pensado em soluções que simplifiquem o uso de equipamentos para o sistema CRISPR em comparação com outros tipos de testes diagnósticos baseados na detecção de ácidos nucleicos.

“O que exige equipamentos mais robustos são, principalmente, a pré-amplificação da amostra, necessária para ampliar a sensibilidade dos testes, e a detecção final da molécula-repórter do ensaio. Embora muitos estudos usem termocicladores para realizar PCRs, técnicas de amplificação isotermal podem ser consideradas de modo a simplificar essa necessidade para apenas termoblocos ou banhos secos. Para a leitura final, dependendo da estratégia empregada no ensaio, podem ser utilizados leitores de placa sem ou com fluorescência, mas também várias metodologias para detecção visual com luz de LED, por exemplo, estão sendo desenvolvidas, entre inúmeras outras possibilidades. Por último, importante lembrar sempre da necessidade de freezers de ultrabaixa temperatura para armazenagem das soluções, moléculas de ácidos nucleicos e enzimas utilizadas.”

O Dr. João Renato Rebello Pinho, coordenador do Comitê Científico de Diagnóstico Molecular da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial (SBPC/ML), comenta que: “para aumentar a sensibilidade dos testes, eles em geral são associados a outras técnicas de amplificação realizadas previamente, mas, em geral, técnicas isotérmicas ou em temperatura ambiente, idealmente.”

Dr. Pinho ressalta que: “a principal vantagem do sistema CRISPR em laboratório será a simplicidade, com a possibilidade de utilização como testes point-of-care para diagnóstico rápido e em locais mais simples.”

Mas vários desafios ainda precisam ser superados, como a necessidade de pré-amplificação da amostra, como comentou Jenifer. Outra desvantagem, que é inerente ao sistema e é um ponto de atenção para todas as aplicações da técnica de CRISPR, é a possibilidade de ligação e clivagens inespecíficas, o que é chamado de efeito off-target. “Várias abordagens podem ser utilizadas para minimizar esse efeito, e normalmente análises bioinformáticas especializadas precisam ser consideradas para o desenho do sistema.”

Porém, Abreu comenta que: “muitos grupos têm trabalhado no aprimoramento da especificidade do sistema, e este desafio (efeito off-target) já não parece longe de ser superado.”

Ética no uso da terapia gênica

Ao falar em CRISPR, é quase natural pensar nos limites éticos de uso do sistema. Apesar das diversas possibilidades de uso da técnica, esses estudos trazem muitas implicações éticas, levantando questões como: quais são os limites para as aplicações do sistema CRISPR? Por isso, o portal LabNetwork ouviu também Anor Sganzerla, doutor em Filosofia pela Universidade Federal de São Carlos (SP) e professor adjunto do Curso de Filosofia e professor permanente do Programa do Pós-Graduação Stricto Sensu em Bioética da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR).

“A CRISPR é uma técnica nova, promissora, que tem encantado a humanidade e a ciência. Nela, depositam-se muitas esperanças e promessas, mas também temores, pois é próprio da técnica, como afirma o filósofo Hans Jonas, ser ambivalente, ou seja, aquilo que se apresenta como esperança também contém perigo. Mas pode-se dizer que a técnica CRISPR tem sido usada no meio científico com bastante consciência, prudência e responsabilidade”, analisa Sganzerla.

Ele comenta ainda que: “por ser uma técnica ambivalente, não é mais possível separas as promessas dos riscos. Entre as grandes questões éticas que o tema suscita, pode-se indagar: curar ou melhorar a humanidade para quê? Para que toda a humanidade possa ter uma melhor qualidade de vida, ou para que alguns poucos possam ter qualidades, capacidades e possibilidades maiores que os outros para se destacar e ter vantagens sobre os outros? Em outras palavras, quais seriam os grandes interesses em torno dessa técnica? A quem deve pertencer essa capacidade de realizar? Ao Estado? À livre iniciativa? A quem pode pagar?”.

Ele elenca como um dos desafios da terapia gênica encontrar princípios éticos de orientação, de modo a impedir que a busca pelo domínio e controle da vida fira a dignidade do ser humano. “Outro desafio que não pode ser ignorado é como usar a técnica para não aumentar a desigualdade social existente.”

Ele complementa dizendo que também é preciso evitar posições alarmistas, como também de um utopismo ingênuo, que em nome de um possível ganho humano não se reconheça a perfeição do ser humano do modo como somos. “Pode-se dizer que é muito difícil explicar que somos perfeitos da forma como somos, mesmo sabendo das muitas limitações.”

No Brasil, a Lei de Biossegurança, que define princípios para a manipulação genética e para os organismos geneticamente modificados, proíbe o uso do CRISPR em células germinativas humanas, assim como em embriões humanos.

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