Por Dr. André Márcio Murad*

A biópsia líquida é uma tecnologia minimamente invasiva para a detecção de biomarcadores moleculares sem a necessidade de procedimentos mais invasivos como biópsias e cirurgias e que permite aos médicos descobrir uma série de informações sobre uma doença ou um tumor através de uma extração de uma simples amostra de sangue. Células tumorais circulantes ou traços do RNA ou do DNA do câncer no sangue podem fornecer informações valiosas sobre quais tratamentos são mais prováveis e efetivos ​​para o paciente. Novos métodos dedicados permitem enriquecer e purificar a partir desta biópsia líquida:

– DNA tumoral livre circulante (ctDNA)

– Células tumorais circulantes (CTCs)

– Micro-RNA (miRNA) circulante

– Microvesículas extracelulares (incluindo exossomos) contendo miRNA e DNA

O recente interesse em ácidos nucleicos no plasma e soro abriu inúmeras novas áreas de investigação e novas possibilidades para o diagnóstico molecular. Em oncologia, alterações genéticas derivadas de tumor, alterações epigenéticas e ácidos nucleicos virais são encontradas no plasma/soro de pacientes com câncer. Esses achados têm importantes implicações para a detecção, monitoramento e prognóstico de muitos tipos de cânceres.

Biópsia líquida para rastreamento de câncer, estratificação e monitoramento de pacientes

A caracterização molecular do tumor de um paciente para orientar as decisões de tratamento é cada vez mais aplicada em cuidados clínicos e pode ter um impacto significativo no resultado da doença. Estas análises moleculares, incluindo a caracterização de mutações, são tipicamente realizadas em tecido adquirido através de uma biópsia no momento do diagnóstico. No entanto, os tumores são altamente heterogêneos e a amostragem em sua totalidade é um desafio. Além disso, os tumores evoluem com o tempo e podem alterar seu genótipo molecular, tornando as decisões clínicas baseadas em dados históricos de biópsia sub-ótimas.

A medicina personalizada para pacientes com câncer visa a adequar as melhores opções de tratamento para o indivíduo no momento do diagnóstico e durante o tratamento. Para permitir totalmente a medicina personalizada, é desejável ter uma maneira minimamente invasiva e de fácil acesso para determinar e seguir a composição molecular do tumor de um paciente longitudinalmente. Uma dessas abordagens é através de uma biópsia líquida, onde a composição genética do tumor pode ser avaliada através de uma amostra de biofluido. As biópsias líquidas têm o potencial de ajudar os oncologistas a rastrear a doença, estratificar os pacientes com o melhor tratamento e monitorar a resposta ao tratamento e os mecanismos de resistência no tumor. Uma biópsia líquida pode ser usada para a caracterização molecular do tumor e sua natureza não invasiva permite repetir a amostragem para monitorar as mudanças genéticas e a presença, a quantificação ou a ausência do DNA tumoral ao longo do tempo, sem a necessidade de uma biópsia tecidual.

Vantagens do procedimento de biópsia líquida

Como acontece com qualquer intervenção oncológica, a biópsia líquida tem vários pontos fortes que sustentam seu uso no tratamento de vários tipos de câncer. A primeira força é que a biópsia líquida é uma técnica minimamente invasiva.  A biópsia líquida é uma técnica menos invasiva que pode ser realizada com maior frequência e com menor morbidade que a biópsia convencional. Essas características são especialmente importantes para a tomada de medidas temporais da carga tumoral e para analisar a possibilidade de recorrência e malignidade, além do fato de que todos os perfis genômicos do tumor podem ser analisados em tempo real.

A biópsia líquida fornece informações genéticas precisas para a investigação e análise de diagnósticos essenciais de mutações e demais variantes genéticas, além de reunir claras vantagens sobre as biópsias teciduais convencionais, porque elas são uma fonte de componentes e materiais celulares frescos e confiáveis ​​derivados de tumores, não contaminadas por qualquer forma de preservação.

Na biópsia líquida, a quantidade de DNA livre circulante que se extrai do sobrenadante do sangue periférico é restrita (menos que 1%). Embora existam exames oferecidos em Reação de Polimerase em Cadeia em Tempo Real (PCR-RT) como o COBAS® (aprovado pelo FDA), para a análise do EGFR (incluindo a mutação de resistência T790M), o qual oferece uma especificidade elevada, o problema recai na baixa sensibilidade, o que demanda a execução de uma biópsia tumoral, quando seu resultado é negativo. Por isto novas tecnologias que elevam a sensibilidade do método têm sido utilizadas, como o emprego do PCR digital (como as técnicas de dd-PCR  – digital em gotas e o BEAMING – beads, emulsions, amplification and magnetics), e o NGS (sequenciamento de nova geração) com tecnologia de captura híbrida e sequenciamento digital, tecnologias estas que permitem identificar e distinguir sequências de variantes verdadeiras de artefatos provocados pela reação de PCR, e com maior precisão que as técnica usuais de NGS utilizadas para análise de tumores parafinados. Estas novas tecnologias permitem uma maior sensibilidade que a biópsia líquida, que em breve deverão ser utilizadas em uma gama enorme de tumores e indicações clínicas, desde o diagnóstico molecular, o prognóstico e a escolha do tratamento até a monitorização do mesmo, com a detecção imediata da resposta, resistência e progressão tumorais.

Estudos recentes sugerem eficácia da biópsia líquida na detecção de mutações, alterações do número de cópias e fusões de vários genes, como EGFR, PIK3CA, BRAF, KRAS, ERBB2, ALK, ROS1, MET, PDGFR e KIT. Uma vez detectando-se tais variações, o tratamento poderia então ser imediatamente instituído, o que pode inclusive dispensar a necessidade da biópsia do tecido tumoral, caso este não esteja disponível. Adicionalmente, a biópsia do tumor representa apenas um único período de tempo de um único local da presença tumoral, e pode ser inadequado para caracterizar um tumor por causa da heterogeneidade intratumoral e intermetastática. Já o DNA do tumor circulante oferece uma ferramenta em tempo real para monitorar em série as alterações genômicas do tumor de uma maneira não invasiva, fornecendo biomarcadores genéticos acessíveis para o diagnóstico de câncer, prognóstico e resposta à terapia.

Quais tecnologias são usadas para analisar o ctDNA?

Os métodos moleculares mais comumente usados ​​para analisar ctDNA são PCR quantitativo (qPCR), PCR digital de gotas (ddPCR) e NGS.  Ambos os métodos de PCR envolvem o uso de sondas de DNA específicas para atingir genes específicos, e a saída de dados é uma medida quantitativa do número de alvos na amostra. O NGS também envolve o uso de sondas para capturar fragmentos de DNA específicos, mas a resultante dos dados é a sequência do DNA capturado.  Como várias leituras podem ser usadas para avaliar o número de moléculas alvo presentes, medições quantitativas também podem ser feitas com o NGS:

qPCR: entre os métodos moleculares discutidos aqui, o qPCR foi desenvolvido o mais cedo.  O qPCR é sensível o suficiente para a análise do cfDNA e possui os benefícios de ser barato e eficiente ao analisar um pequeno número de variantes. No entanto, os ensaios de qPCR são limitados a poucos alvos gênicos e avaliam apenas os tipos de variantes especificados, oferecendo pouco valor de identificação.

ddPCR: a tecnologia dd-PCR (Reação de Polimerase em Cadeia com Tecnologia Digital em Gotas), oferece uma maior sensibilidade para a detecção de alterações gênicas em amostras com quantidades restritas de DNA, como as utilizadas na biópsia líquida. No sistema de dd-PCR Digital, uma amostra é dividida em 20.000 gotas e cada gota tem seu DNA ou RNA amplificado, sendo que as alterações genéticas procuradas são facilmente detectadas por fluorescência. O PCR digital oferece adicionalmente custos menores que o NGS e maior rapidez nos resultados. Estas ferramentas são essenciais para a prática da denominada oncologia de precisão ou personalizada, tanto na seleção terapêutica de alvos para a terapia (por ex.: mutações do EGFR para indicação de terapia anti-EFGR em câncer de pulmão de células não pequenas avançado) quanto no monitoramento de recidivas e progressão tumoral, como na detecção da mutação de resistência secundária. O ddPCR é superior ao qPCR em precisão, embora haja custos adicionais e conhecimentos técnicos associados. O ddPCR também não possui considerável valor de identificação, pois o número de alvos e tipos de variantes gênicas são limitados ao desenho do ensaio específico.

NGS: como envolve a resolução de nucleotídeo único das sequências de DNA, a capacidade de identificação de novas variantes é possível sem o conhecimento prévio incluído no projeto do ensaio.  Isso permite não apenas a avaliação de vários tipos de variantes, mas também a descoberta de mutações em um novo local de um gene.  Assim, com uma abordagem “livre de hipóteses”, o NGS fornece alto valor de identificação que pode ser útil na avaliação de qualquer tumor com potencial para apresentar novas variantes.  Quando os ensaios são desenhados para cobrir maior número de alvos moleculares, como em um Painel Customizado, a natureza abrangente do NGS pode fornecer valor em eficiência e economia de custos.

Que vantagens o NGS oferece para biópsia líquida?

O NGS envolve milhões de fragmentos de DNA sequenciados em paralelo, seguidos pelo alinhamento computacional das leituras no genoma.  Dependendo do desenho do ensaio, o NGS pode ser altamente abrangente com um grande número de alvos de genes e tipos de variantes.  Na medida que o número de biomarcadores acionáveis ​​nos tratamentos contra o câncer continua a crescer, a capacidade de se consolidar um grande número de biomarcadores em um teste provavelmente se tornará mais valiosa nas pesquisas e nos ambientes clínicos, reduzindo o número de testes necessários para encontrar respostas significativas.  O NGS tem o potencial de permitir economia de amostra, tempo e dinheiro, evitando testes iterativos.

As opções para a preparação da biblioteca de sequenciamento, como a tecnologia da captura híbrida, permitem que grandes fragmentos de genes direcionados sejam retirados das amostras de ctDNA.  As sondas de hibridação podem ser projetadas para serem grandes o suficiente para capturar alvos, mesmo quando existem mutações nas regiões hibridizadas.  O sequenciamento subsequente dos alvos capturados permite a descoberta de novas mutações para as quais não é necessário conhecimento prévio durante o desenho do ensaio.

Os ensaios NGS podem ser projetados para atingir um grande número de genes com baixa profundidade de sequenciamento (mais abrangente, menos sensível) ou um número relativamente pequeno de genes com maior profundidade de sequenciamento (menos abrangente, mais sensível).  No caso de biópsia líquida, na qual a fração de ctDNA em uma amostra de ctDNA é potencialmente baixa, é necessária uma profundidade de sequenciação alta para fornecer a sensibilidade para detectar com precisão as variantes de baixa frequência. Portanto, embora os painéis genômicos em NGS existam com conteúdo muito abrangente, a aplicação à biópsia líquida foi limitada até recentemente devido a problemas de sensibilidade.

As recentes melhorias na instrumentação de sequenciamento como a captura híbrida e o sequenciamento profundo fornecem opções para amostras de sequenciamento com uma profundidade extremamente alta de cobertura de sequenciamento para grandes porções do genoma em uma única amostra. Ao fornecer um valor abrangente combinado a alta sensibilidade e especificidade, o NGS permite a análise de centenas de genes com a profundidade de sequenciamento necessária para a análise precisa do ctDNA. Esses recursos não apenas fornecem a avaliação de um grande número de mutações conhecidas, mas também permitem a descoberta de novas mutações driver na pesquisa do câncer.

Perspectivas futuras: os exossomos – a oportunidade de se avaliar o transcriptoma tumoral pela biópsia líquida

Os exossomos são vesículas nanométricas membranosas especializadas derivadas de compartimentos endocíticos que são liberados por muitos tipos de células. Microvesículas são distintas de exossomos uma vez que eles são produzidos por derramamento da membrana plasmática e geralmente maiores em tamanho (> 1 µm). A biogênese do exossomo envolve o processo rigidamente controlado de brotamento interno da membrana limitante de corpos multivesiculares (MVBs). Isto resulta em numerosas vesículas intraluminais no lúmen de MVBs que contêm repertórios proteicos distintos.

Tem sido sugerido que as microvesículas liberadas por certas células tumorais contêm RNA mensageiro funcional (mRNA), e que por sua vez pode promover a progressão tumoral. Exossomos purificados contêm microRNAs funcionais (miRNAs) e são especializados em transportar pequenos RNA incluindo os miRNAs reguladores de 22-25 nucleotídeos de classe. Esse RNA tem sido utilizado para sequenciamento (RNAseq) através da biópsia líquida, oferecendo assim o estudo transcriptômico tumoral.

Bibliografia básica

1. Marc Beishon – What can we learn from liquid biopsies?. CancerWorld, Number 68 Sept-Oct. 2015 https://cancerworld.net/cutting-edge/what-can-we-learn-from-liquid-biopsies/

2. Parikh AR, Leshchiner I, Elagina L, et al. Liquid versus tissue biopsy for detecting acquired resistance and tumor heterogeneity in gastrointestinal cancers. Nat Med. 2019;25(9):1415-1421.

3. Leighl NB, Page RD, Raymond VM, et al. Clinical Utility of Comprehensive Cell-free DNA Analysis to Identify Genomic Biomarkers in Patients with Newly Diagnosed Metastatic Non-small Cell Lung Cancer. Clin Cancer Res. 2019;25(15):4691-4700.

* Professor Adjunto Coordenador da Disciplina de Oncologia da Faculdade de Medicina da UFMG é Diretor Clínico da Personal – Oncologia de Precisão e Personalizada e Diretor Científico do Laboratório Personal de Genética Molecular de Belo Horizonte, MG. Pós-Doutor em Genética pela UFMG. Diretor Científico do GBOP. Consultor científico da Twist Bioscience e Molecular Biotecnologia.

Contatos:
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Tags:

biomarcadores moleculares, biópsia líquida, tumor

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