Protocolo desenvolvido por grupo do Centro Conjunto Brasil-Reino Unido para Descoberta, Diagnóstico, Genômica e Epidemiologia de Arbovírus foi usado para analisar amostra do primeiro paciente com diagnóstico confirmado no Brasil. Tecnologia poderá ser útil para detectar novos vírus emergentes

No caso da metagenômica são usados primers aleatórios, que possibilitam sequenciar todo o material genético contido em uma amostra biológica, inclusive o do hospedeiro e de outros patógenos que ele eventualmente albergue. Em seguida, essas informações são analisadas por técnicas de bioinformática e comparadas com um painel de referências.

Pesquisadores do Centro Conjunto Brasil-Reino Unido para Descoberta, Diagnóstico, Genômica e Epidemiologia de Arbovírus (CADDE) concluíram em apenas 18 horas o sequenciamento completo do genoma do vírus monkeypox (MPXV) isolado do primeiro paciente com diagnóstico de varíola dos macacos confirmado no Brasil.

O feito tornou-se possível graças à adaptação para o MPXV de uma técnica de metagenômica rápida desenvolvida durante o doutorado de Ingra Morales Claro, bolsista da Fapesp. O trabalho foi coordenado pela professora da Universidade de São Paulo (USP) Ester Sabino, que também esteve à frente do primeiro sequenciamento de SARS-CoV-2 no país, em março de 2020, e dos primeiros casos da nova variante gama, surgidos em Manaus cerca de um ano depois.

A equipe do CADDE divulgou os resultados no dia 09 de junho no virological.org, site em que virologistas de todo o mundo compartilham informações sobre patógenos de interesse em tempo real.

“Recebemos a amostra de um paciente internado no Hospital Emílio Ribas às 16 horas de terça-feira [07/06] e às 10 horas da manhã seguinte o genoma do vírus, que tem quase 200 mil pares de bases [bem mais que as 30 mil do SARS-CoV-2], estava sequenciado e analisado. A metodologia que desenvolvemos é, em média, 45% mais rápida do que as técnicas de metagenômica convencionais. E o custo também é menor, podendo chegar a US$ 30 por amostra”, conta Claro.

Como explica Sabino, os cientistas costumam recorrer a análises metagenômicas quando precisam identificar um novo vírus emergente (como foi o caso do SARS-CoV-2 em 2019) ou detectar em amostras de pacientes um vírus já conhecido sem ter em mãos os reagentes específicos necessários (como ocorre agora com o MPXV).

Isso porque o teste de RT-PCR, padrão-ouro para diagnóstico da Covid-19 e de várias outras doenças, requer os chamados primers (iniciadores), que são sequências de nucleotídeos complementares às sequências virais que iniciam a replicação do material genético. E o resultado depois precisa ser comparado com controles negativos e positivos.

“Quando tem início uma epidemia por um agente infeccioso novo, um dos grandes gargalos para o diagnóstico dos casos é a falta de primers específicos e de controles positivos. Essa técnica pode ser útil nessas situações, pois permite identificar patógenos ainda desconhecidos, para os quais não há reagentes”, explica Sabino.

E quanto mais cedo ocorre a detecção do caso “index” (o primeiro caso), maior a probabilidade de contenção de um vírus emergente, acrescenta Claro.

No caso da metagenômica são usados primers aleatórios (não específicos para um determinado vírus ou bactéria), que possibilitam sequenciar todo o material genético contido em uma amostra biológica, inclusive o do hospedeiro (humano, no caso) e de outros patógenos que ele eventualmente albergue. Em seguida, essas informações são analisadas por técnicas de bioinformática e comparadas com um painel de referências.

“Exatamente como foi feito com o MPXV. Os dados obtidos foram mapeados em uma sequência do vírus já disponível para estudos. E isso nos permitiu comprovar que se tratava do monkeypox”, diz Claro.

Encurtando caminhos

A confirmação oficial do primeiro caso brasileiro de varíola dos macacos foi feita no dia 09 de junho pelo Instituto Adolfo Lutz. O laboratório de referência paulista conduziu a análise metagenômica em uma plataforma conhecida como Illumina, uma das tecnologias que tem sido usada para detectar o MPXV nos centros europeus e norte-americanos e considerada padrão-ouro. O sequenciamento por esse método leva em média 48 horas para ser concluído.

Já o grupo do CADDE usou um sequenciador portátil conhecido como MinION, da Oxford Nanopore Technologies, e fez adaptações no protocolo usado para sequenciar o vírus zika (a partir de 2015) e o SARS-CoV-2 (a partir de 2020), tornando-o mais rápido.

“Uma das vantagens deste novo protocolo é a redução no tempo de preparo da amostra para sequenciamento, que passa de 14 horas para 5h40 minutos”, relata Claro.

Como a taxa de erro é um pouco mais elevada que a da plataforma Illumina, a equipe do CADDE buscou gerar até 300 leituras (reads) redundantes para cada região do genoma viral. “Quando cobrimos diversas vezes a mesma região e encontramos o mesmo resultado, podemos ter certeza de que não se trata de um erro de leitura”, diz a pesquisadora.

O passo seguinte foi montar a árvore filogenética do MPXV isolado no Brasil. Para isso, a equipe do CADDE comparou a sequência obtida na USP com outras 102 divulgadas este ano por cientistas de países como Bélgica, Portugal, Reino Unido, Alemanha, Espanha e Estados Unidos. O objetivo foi mensurar o grau de similaridade entre as sequências, o que dá pistas sobre as relações evolutivas.

“Baixamos todos os genomas completos sequenciados em 2022 [até 09/06], alinhamos as sequências e montamos a árvore filogenética. Vimos que o MPXV detectado aqui se encaixa em um grande clado [grupo], o mesmo em que estão os vírus sequenciados na Europa e nos Estados Unidos. Quando comparamos com o genoma de referência do CDC [o Centro de Controle de Doenças norte-americano], atualizado em maio, observamos somente três mutações”, conta Claro.

A título de comparação, o primeiro genoma de MPXV sequenciado em 2022 apresentou 47 mutações em relação ao último caso até então descrito (em 2018, na África).

“O que essas mutações representam e se de alguma forma elas contribuíram para o aumento no número de casos é algo que ainda está sendo estudado por outros grupos de pesquisa. Nós aqui no CADDE vamos ficar de olho nos próximos casos. A ideia é continuar sequenciando para monitorar a evolução do vírus”, revela Claro.

Embora seja conhecido por causar a varíola dos macacos ou varíola símia, o MPXV é um vírus que infecta principalmente roedores na África. O patógeno integra a família Orthopoxvirus, a mesma do vírus da varíola humana, erradicada em 1980.

A doença geralmente começa com febre, fadiga, dor de cabeça, dores musculares, ou seja, sintomas inespecíficos e semelhantes aos de resfriado ou gripe. Alguns dias após o início da febre aparecem as lesões na pele, que contêm alta carga viral. A disseminação se dá pelo contato direto com as feridas ou com roupas, lençóis e toalhas usadas por alguém com as lesões na pele. Também pode ocorrer pela tosse ou espirro de pessoas infectadas.

Até o início deste ano, a infecção era comum apenas na África Central. Mas novos casos já foram detectados em 33 países, a maioria sem histórico prévio da doença. Com informações da Fapesp

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metagenômica rápida, sequenciamento completo do genoma do vírus monkeypox

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