Saiba no artigo a seguir como a nova geração do PCR, a ddPCR, permite que tenhamos reações mais robustas, com mais resistência a inibidores e com quantificação absoluta 

Na ddPCR, a amostra é fracionada em até 20.000 gotas. Cada uma abriga uma reação de PCR independente

A sigla ddPCR vem de Droplet Digital Polymerase Chain Reaction, conhecida em português como PCR Digital em Gotas, ou ddPCR.

O melhor de dois mundos

No final da década de 80, o bioquímico Kary Mullis, junto com seu colega Michael Smith, desenvolveu um método de replicar sequências de DNA, chamada Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês: Polymerase Chain Reaction ou PCR). A PCR tradicional utiliza a técnica chamada de end-point, ou seja, a análise é realizada em um gel de agarose após o término da reação de PCR. Assim, a análise é qualitativa, permitindo a detecção de presença ou ausência da sequência esperada. Ela, no entanto, não permite uma quantificação do número cópias da sequência-alvo na amostra.

Passada a época de detectar ou não a presença de uma sequência, é então necessário avaliar sua quantidade, proporção ou concentração. Quanto deste medicamento diminui a expressão do gene X? Quantas vezes este gene sofreu mutação neste tumor? Qual é a carga viral neste paciente? Temos então a era do PCR em Tempo Real, ou qPCR. Ela permite a análise, via marcador fluorescente, à medida que cada ciclo da reação ocorre (por isso o nome de Tempo Real). A qPCR necessita, portanto, de controles (um grupo de referência ou uma curva padrão) para normalizar seu resultado.

Temos dessa forma o número de vezes em que uma sequência é mais expressa (ou menos) do que o controle e, com isso, uma quantificação só pode ser realizada na presença de um material de referência com concentrações do alvo conhecidas (curva padrão). Desta forma, a qPCR é uma técnica semiquantitativa, já que não conta de forma absoluta as cópias amplificadas. Além disso, variações na eficiência da amplificação podem afetar a qualidade do resultado final.

Nas últimas décadas foi desenvolvido um método que possibilita a quantificação absoluta, resultando em uma contagem precisa do número de cópias do DNA/RNA em uma amostra. Desenvolve-se uma nova geração de PCR, a ddPCR. Ela, por sua vez, conta com a solidez de uma reação end-point, facilitando a detecção de eventos raros ricas em inibidores e, também, a sensibilidade da PCR em Tempo Real como base para uma quantificação absoluta com alta sensibilidade e precisão.

E como a ddPCR funciona?

A amostra a ser amplificada é particionada em 20.000 gotas juntamente com os reagentes inerentes a uma reação de PCR. Cada uma destas gotas abrigará uma reação de PCR independente; com isso,  são geradas 20.000 replicatas de uma reação end-point. Cada uma destas gotas é analisada por um sistema semelhante a um citômetro de fluxo, no qual se detectam gotas positivas (que tiveram amplificação da sequência-alvo) e/ou negativas.

Este fracionamento permite que eventos raros possam ser isolados daqueles com maior ocorrência além de favorecer a diminuição drástica do volume residual (prejudicial para a análise de eventos raros). Desse modo, sequências com baixa expressividade têm maior disponibilidade na reação. Além de tudo, o fracionamento também diminui a concentração de fatores inibitórios à PCR, resultando em uma reação limpa, eficiente, precisa e contável.

Quais são as aplicações da ddPCR?

A ddPCR pode ser aplicada a qualquer análise na qual a sequência-alvo é rara, ou que tenham considerável quantidade de inibidores, ou que o volume de amostra é escasso.

Somada à necessidade de alta precisão, à quantificação absoluta e ao isolamento do viés de eficiência de amplificação, a ddPCR é a solução ideal para uma alta precisão em amostras difíceis. Desta forma, a ddPCR pode ser aplicada nos seguintes casos:

– Quantificação absoluta

– Alterações genômicas, como CNV (Copy Number Variation)

– Detecção de sequências raras

– Biópsia líquida

– Detecção de patógenos

– Expressão gênica e análise de microRNA

– Quantificação de bibliotecas para NGS (Next Generation Sequencing)

– Análises single cell

– Detecção de edição de genoma

– Monitoramento de solo e água

– Análise de alimentos

– E outros casos mais.

Essas e muitas outras aplicações podem ser desenvolvidas utilizando a tecnologia de ddPCR.

O que a medicina pode ganhar com esta tecnologia?

Um dos desafios ao estudar o perfil molecular de tumores é a sensibilidade limitada do qPCR. A detecção de mutações raras em amostras de Biópsia Líquida ou Fixadas em Formalina e Incluídas em Parafina (FFPE) necessita de numerosas replicatas para obter uma relevância biológica estatística. Isto pode gerar um aumento significativo no custo e tempo para condução dos ensaios. A ddPCR, por sua vez, é capaz de detectar sequências raras em um volume escasso de amostra, diminuindo tempo e/ou custo com aumento de sensibilidade e precisão.

A ddPCR também pode auxiliar a tecnologia de NGS na medicina personalizada. Embora o uso do NGS tenha se propagado, seu custo ainda é bem expressivo. Quando buscamos um mapeamento de mutações e/ou genes do tumor, o custo/gene se torna relativamente baixo por ser dividido por todos os genes. No entanto, em situações nas quais já sabemos quais genes serão os alvos (i.e. monitoramento de tratamento ou recidiva), seu custo/gene se torna consideravelmente alto, dado que o custo da reação é dividido por poucos genes de interesse. Desta forma, o uso do ddPCR nos fornece uma alta precisão com um menor custo por gene.

Conteúdo elaborado pela Bio-Rad.
Mais informações: [email protected]

Tags:

ddPCR, Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

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